그람 염색 기초, 재료, 기술 및 용도



그 그람 염색 진단 미생물학에서 가장 간단하고 유용한 염색 기술입니다. 이 기술은 1884 년 덴마크의 한스 크리스티안 그램 (Hans Christian Gram)에 의해 만들어졌으며 세포벽의 구성에 따라 그람 양성균과 그람 음성균으로 박테리아를 분류했습니다.

이 기술은 시약을 안정시키고 얼룩의 품질을 향상시키기 위해 Hucker가 1921 년에 수정 한 것입니다. 그람 염색은 Gram-Hucker.

이 기술로 미생물이 가지고있는 형태, 즉 그들이 cocci, bacilli, coccobacilli, pleomorphic, filamentous인지 여부도 관찰 할 수 있습니다. 공간에서의 분포뿐 아니라 클러스터 내, 체인 내, 격리 된, 쌍으로, 사중 등으로 분포합니다..

세균 감염이 의심 될 때,받은 샘플의 대부분은 슬라이드에 펼쳐야하고 그램으로 현미경으로 검사해야합니다..

그람의보고는 작물의 최종 결과를 얻기 전에 어떤 종류의 미생물이 감염의 원인이 될 수 있는지 의사에게 안내 할 것입니다.

어떤 경우에는 환자의 생명이 매우 손상되기 때문에 미생물의 확인을 기다리는 동안 의사는 긴급히 그램 보고서가 필요합니다..

그람이 CSF에서 존재 그람 양성 구균 밝혀 예를 들어, 의사는이 확립 프로토콜에 따른 박테리아의 이러한 유형을 제거하는 초기 항생제 안내.

일단 최종 결과가 격리 된 미생물 및 각각의 항생제의 이름과 함께 도착하면, 의사는 치료를 바꿀지 여부를 평가할 것입니다. 이 결정은 환자가받는 항생제에 대한 미생물의 감수성과 환자의 진화에 대한 연구에 따라 결정될 것입니다.

색인

  • 1 재단
  • 2 재료
  • 3 염료 및 시약 준비
    • 3.1 크리스탈 바이올렛 용액
    • 3.2 Iodo-Lugol
    • 3.3 표백
    • 3.4 대비
  • 4 시약 저장
  • 5 착색 될 표본의 펼침 준비
    • 5.1 - 직접 샘플 그램
    • 5.2 - 작물 그램
  • 6 기술
  • 7 유틸리티
  • 8 가지 일반적인 실수
  • 9 참고 문헌

재단

이것은 4 가지 기본 단계를 나타내는 기술입니다 : 염색법, 매염제와의 고정, 변색 및 반대. 따라서이 기술은 박테리아를 채색하는 것 외에도 이들을 차별화합니다.

크리스탈 바이올렛 염색 먼저 사용된다. 세포 내 단백질 ribonuclear - 그것은 루골 같은 매염 작용 배치되도록, 크리스탈 바이올렛 - 요오드 불용성 복합체의 형성을 유도 할 것이다 후 펩티 자주색 얼룩 모든 박테리아에 대한 친 화성을 갖는다.

펩티도 글리 칸이 두꺼운 벽을 가지고있는 그람 양성균은 더 많은 복합체 (크리스탈 바이올렛 - 요오드)를 형성하므로 염료를 보유합니다.

그람 양성균 벽에는 산화제에 대한 높은 친 화성을 나타내는 불포화 지방산이 많이 포함되어있다 (Lugol).

그람 음성 박테리아는 펩티도 글리 칸이 얇아서 그람 양성균보다 박테리아가 덜 복잡합니다..

그런 다음 그람 양성균과 그람 음성균이 다르게 행동하는 변색 단계가옵니다.

그램 음성 박테리아는 세포벽의 일부인 리포 다당류가 풍부한 외막을 포함합니다. 지방은 알코올 아세톤과의 접촉에 의해 파괴되므로 외막이 불안정 해지고 바이올렛 결정이 방출됩니다.

이것은 safranin이나 basic fuchsin으로 다시 염색하는 방법입니다..

그람 양성 세균의 경우, 벗어날 수 바이올렛 / 요오드 복잡한 결정을 방지, 탈색이 기공을 닫도록 작용한다는 바래지.

따라서 바이올렛 결정의 착색은 안정적이며 사 페라닌 또는 푹신 (fuchsin)의 여지가 없습니다. 이 때문에 박테리아는 강렬한 청색 또는 자색으로 얼룩지게됩니다..

재료

그램 색소 세트는 다음으로 구성됩니다.

  • 바이올렛 크리스탈
  • 루골
  • 아세톤 알코올
  • 사 프리 닌 또는 염기성 푹신

염료 및 시약의 제조

크리스탈 바이올렛 용액

솔루션 A :

바이올렛 크리스탈 -2 gr

에틸 알코올 95 % -20cc

솔루션 B :

암모늄 옥살산 염 -0.8 gr

증류수 - 80 cc

보라색 결정의 최종 제조를 위해, 1:10 용액을 증류수로 희석하고 용액 B 4 부와 혼합해야한다. 혼합물을 사용하기 전에 24 시간 동안 저장한다. 종이 필터를 사용하여 앰버 염색을 위해 플라스크에서 여과한다.

매일 사용되는 양은 점 적기가있는 호박 병으로 옮겨집니다..

이도 루골

다음과 같이 표시된 각 화합물의 무게를 달고 측정하십시오 :

Iodo의 결정체 - 1gr

칼륨 요오드화물 - 2gr

증류수 - 300 cc

요오드화 칼륨은 물에 조금씩 녹고 요오드가 첨가됩니다. 용액을 호박색 병에 깎습니다..

매일 사용되는 양은 점 적기가있는 더 작은 앰버 병으로 옮겨집니다..

표백

95 % 에틸 알코올 -50 ml

아세톤 - 50 ml

동등한 부분으로 준비되어 있습니다. 잘 덮어서 증발하는 경향이있다..

점 적기가있는 병에 넣으십시오..

이 준비는 적당한 시간 5-10 초에 변색을 제공하며 가장 권장됩니다.

초보자는 변색이 10 ~ 30 초보다 느린 경우 95 % 에틸 알콜 만 사용하는 것을 선호합니다..

가장 경험이 많은 사람은 순수한 아세톤을 사용할 수 있지만 변색이 1 초에서 5 초 사이에 매우 빠르게 일어난다..

대비

사프란 재고 솔루션

사 프라 니나 -2.5 gr

에틸 알코올 95 % -100 cc

계량 후 표시된 양의 사 프리 닌은 100 cc의 에틸 알콜에 용해되어 95 %.

작용하는 사 프리 닌 용액은 스톡 용액.

이를 위해 원액 10 cc를 측정하고 90 cc의 증류수를 넣어 100 ml.

스포이드로 호박 병에 매일 사용할 양을 옮기는 것이 좋습니다.

특정 혐기성 ​​균과 같은 그람 - 허커 (Gram-Hucker) 염색으로 약하게 염색되는 미생물, Legionella sp, Campylobacter sp 및 Brucella sp, Gram-Kopeloff 염색이라 불리는 그람 - 허커 (Gram-Hucker) 염색법에 대한 코펠 로프 (Kopeloff)의 변형이 사용된다면 훨씬 더 잘 염색 될 수 있습니다.

이 기술은 기본 푹신에 의해 safranin 염료를 변경합니다. 이러한 변형에 의해, 전술 한 미생물을 효과적으로 발색시키는 것이 가능하다.

시약 저장

준비된 염료는 실온에서 보관해야합니다..

시료 채색 준비

샘플은 적어도 10을 포함해야합니다.5 미생물 관찰에 앞서 미생물이 번질 가능성이 높습니다. 직접 샘플 또는 고체 또는 액체 배지에서 배양하여 퍼짐을 만들 수 있습니다..

스프레드는 균일하고, 잘 분산되어 있고, 너무 두껍지 않아야 현재의 구조를 더 잘 시각화 할 수 있습니다..

-직접 샘플 그램

원심 분리없이 소변 그람

소변을 혼합하고 10 μl를 슬라이드에 놓습니다. 최소한 하나의 박테리아 / 침지 영역 관찰은 감염이 있음을 나타냅니다.

즉, 배양 물은 대략 10 만 CFU / ml (105 CFU / mL) 소변의 85 %.

이 방법은 100,000 CFU 미만의 식민지 수에는 유용하지 않습니다..

LCR 그램

CSF를 원심 분리하고 상층 액을 제거하고 펠릿을 슬라이드에 펼쳐 놓아야합니다. 이 액체는 정상적인 조건에서 살균됩니다. 박테리아의 관찰은 감염을 나타낸다..

호흡기 샘플 그람

기관지 또는 기관지 폐포 세척액 인 가래 그램은 다양한 미생물이있을 수 있지만 항상 진단에 도움이 될뿐만 아니라 관찰되는 세포의 유형.

가래의 경우, 도말은 시료의 가장 고순도 인 부분으로 준비해야합니다.

의자 그램

이 유형의 샘플에는 진단 값이 없으므로 그램을 수행하지 않는 것이 좋습니다.

-그람 작물

그들은 액체 작물과 고체 작물의 두 가지 방법으로 수행 될 수 있습니다..

액체 작물

액체 배양에서 매우 간단합니다. 상기 둘레 방향 중심에서 원 운동을주는 물질을 균일하게 분산, 라이터 여러 볶은 더러운 국물 아래 그들이 촬영 깨끗한 건조 씌우고.

그것은 공기 중에 자발적으로 건조하는 것이 허용됩니다. 일단 건조되면, 재료는 열로 시트에 고정됩니다. 이를 위해 클램프를 사용하여 Bunsen 버너의 불꽃을 통해 시트 3을 4 번 통과시켜 재료를 태우지 않도록주의합니다.

시트를 냉각시키고 착색 다리에 놓는다..

단색 작물

고체 배양 물에서 그람 염색을위한 확장을 수행하려면 다음과 같이 진행하십시오 :

채취 할 콜로니를 선택하기 전에 슬라이드를 준비해야하며 약 2 방울의 무균 생리 식염수 용액.

원래의 배양 판에 몇 가지 다른 유형의 콜로니가 포함되어있는 경우, 각각의 분리 된 콜로니가 그램을 수행하도록 선택됩니다. 각 식민지는 이전에 슬라이드에 배치 된 식염수 용액에 녹이기 위해 백금 루프로 채취합니다.

원형 운동은 중심에서 주변으로 주어 식민지를 슬라이드에 균등하게 분배합니다..

그것은 공기 중에 자발적으로 건조하는 것이 허용됩니다. 일단 건조되면 시트는 위에서 설명한 바와 같이 (슬라이드를 라이터로 불타는) 가열로 고정되며, 재료를 태우지 않도록주의하십시오.

이 절차는 각기 다른 유형의 콜로니와 함께 수행되어야합니다. 한 장의 종이에 관찰 된 순서를 기록해 두어야합니다. 예를 들면 다음과 같습니다.

콜로니 1 : 옐로우 베타 - 용혈 콜로니 : 그람 양성 구균이 클러스터에서 관찰되었다

식민지 2 : 크림 콜로니, 용혈 없음 : 그람 음성균이 관찰 됨.

각 시트는 우리가 관찰하고있는 것을 알기 위해 라벨을 붙여야합니다..

기술

그람 염색 기술은 수행이 매우 간단하고 상대적으로 저렴하며 미생물학 실험실에서 놓칠 수 없습니다.

다음과 같이 동일하게 수행됩니다.

  1. 색깔이있는 다리 위에 더위와 장소로 번짐을 고쳐라..
  2. 시트를 1 분 동안 보라색 유리로 완전히 덮습니다..
  3. 물로 씻으십시오. 건조하지 마라.
  4. Lugol 용액으로 판을 덮고 1 분 동안 그대로 두십시오. 물로 씻으십시오. 건조하지 마라..
  5. 아세톤 알콜에서 부드럽게 교반하면서 5-10 초 동안 혼합하십시오. 또는 시트를 직립 위치에 놓고 나머지 보라색 유리가 떨어져 나올 때까지 표면에 탈색제의 방울을 떨어 뜨립니다. 초과하지 마십시오..
  6. 물로 씻으십시오. 건조하지 마라..
  7. 착색 된 교량의 시트를 교체하고 safranin (Gram-Hucker) 또는 basic fuchsin (Gram-Kopeloff)으로 1 분 동안 커버하십시오..
  8. 물로 씻으시오.
  9. 수직 공기에서 자연 건조 가능.

일단 건조되면 1 방울의 침지 오일을 광학 현미경에서 100 배의 목적으로 관찰한다.

유틸리티

이 기술은 대부분의 박테리아의 형태 적 차이를 구별 할 수있게 해줍니다.

효모 또한이 색으로 구별됩니다. 그들은 크리스탈 바이올렛을 가지고 있습니다. 즉 그람 양성균입니다..

반면 그람 양성 포자 형성 세균은 구별 할 수 있는데, 포자가 잘 자라지는 않지만 내부 포자가 형성되는 바실러스 내부에 명확한 공간이 관찰됩니다. 포자를 사용하려면 Shaeffer-Fulton과 같은 다른 기술이 사용됩니다.

이 얼룩은 모든 종류의 박테리아를 채색하는데 도움이되지 않는다는 점에 유의해야합니다. 즉, 얼룩이 효과를 내지 않는 경우가 있습니다.

이 경우 세포벽이없는 박테리아가 언급 될 수 있습니다. 예 : Mycoplasma 속, 구상 체 플라센, 우레아 플라스마, L-form 및 원형질체.

또한 미코 박테리아와 Chlamydias 및 Rickettsias와 같은 세포 내 박테리아와 같은 미 콜산 (mycolic acid)이 풍부한 벽을 가진 박테리아를 심하게 감염시킵니다.

또한 대부분의 spirochetal 박테리아를 얼룩지게하는 것은 비효율적이다..

그람 양성균과 그람 음성균과 같은 샘플에서 볼 수있는 동일한 속의 박테리아가 있습니다. 이런 일이 생기면 변하기 쉬운 그람 염색이라 불리우며 이는 양분, 온도, pH 또는 전해질 농도의 변화로 인한 것일 수 있습니다..

일반적인 실수

지나치게 표백하다

변색 단계에서 과장되면 거짓 그램 음성 미생물의 관찰을 유발할 수있다.

침지 오일을 첨가하기에 충분한 건조 시간을 기다리지 마십시오.:

이 오류는 존재하는 구조를 관찰하기 어렵게 만드는 지방 미셀의 형성을 유발합니다. 이것은 오일이 스미어에있는 물 분자와 결합 할 때 발생합니다.

시약의 순서를 반대로하십시오.:

이와 같은 오류는 그람 음성 박테리아가 자주색 즉, 그람 양성 반응을 일으키는 원인이됩니다.

오래된 작물 (고체 또는 액체) 사용 :

그람 양성균이 그람 음성균 (그람 음성균)을 얼룩지게 할 수 있습니다. 이것은 오래된 문화에서 죽은 또는 악화 된 박테리아가있을 가능성이 높고 이러한 조건에서 박테리아가 보라색 결정을 보유하지 않기 때문에 발생합니다.

아주 오래된 Lugol 솔루션을 사용하십시오.

시간이 지남에 따라 루골은 속성을 잃어 버리고 색이 희미 해집니다. 이미 퇴화 된 시약을 사용하면 크리스탈 바이올렛을 잘 고정시키지 않으므로 미생물의 시각화를 잘못 획득 할 가능성이 있습니다. 그람 음성.

푸르른 배경

제대로 변색 된 배경은 빨간색입니다. 파란색 배경은 변색이 불충분하다는 것을 나타냅니다..

참고 문헌

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