몫:
DNA 시퀀싱 Maxam-Gilbert, Sanger 방법, 예제
그 DNA 시퀀싱 (디옥시리보 핵산)은 관심있는 유전 물질에서 뉴클레오타이드의 순서를 알 수있는 분자 생물학 실험실에서 수행되는 절차입니다. 또한, RNA (리보 핵산)의 시퀀싱 또한 밝혀 질 수 있습니다.
이 기술은 생물 과학의 발전에 없어서는 안되는 기술입니다. 또한 의학 진단 및 법의학 수사와 같은 다른 지식 분야에도 적용 할 수 있습니다.
이전에, DNA 가닥의 시퀀싱은 느리고 값 비싼 활동으로 간주되어 올리고 뉴클레오타이드에서 단지 몇 개의 염기 쌍을 동정 할 수있었습니다.
오늘날 과학의 모든 진보, DNA 시퀀싱 많은 실험실이 분야에서 연구의 거의 50 년간의 기여에 전세계 덕분에 일상적인 작업이다. 사슬 길이, 이들은 단시간 내에 염기쌍 수백만 서열화 될 수있다.
그렇게하기 위해 가격과 정확도가 다른 수십 가지 기술이 개발되었습니다. 이 기사에서는 고전과 현대 기술을 각각 설명하고 장점과 단점을 설명합니다..
지금까지 시퀀싱 기술은 작은 원핵 생물과 효모에서부터 인간 게놈에 이르기까지 일련의 완전한 게놈을 얻을 수있게합니다.
색인
- 1 DNA 구조
- 2 역사
- 3 생거 방법
- 3.1 반응의 주성분
- 3.2 결과 읽기
- 4 자동 시퀀싱
- 5 Maxam-Gilbert 시퀀싱
- 5.1 절차
- 5.2 결과 읽기
- 6 대규모 시퀀싱
- 6.1 파이로 시퀀싱
- 6.2 합성에 의한 시퀀싱
- 6.3 라이 게이션에 의한 시퀀싱
- 6.4 시퀀싱 이온 토런트
- 7 예
- 7.1 인간 게놈의 염기 서열 분석
- 8 중요성 및 응용
- 9 참고 문헌
DNA의 구조
DNA 시퀀싱에 사용되는 방법과 기술을 이해하기 위해서는 분자의 구조와 구성에 대한 핵심적인 측면을 알아야합니다.
DNA는 박테리아에서부터 큰 수생 동물에 이르기까지 모든 생물체에서 발견되는 생체 분자입니다. 오르테셀은 미토콘드리아와 엽록체와 같이 내부에 원형의 DNA 분자를 가지고 있습니다. 일부 바이러스에서도 발견 된 유전 물질은 DNA입니다.
구조적으로, DNA는 뉴클레오타이드 집합입니다. 각각은 탄수화물, 질소 성 염기 (A, T, C 또는 G)와 인산염 그룹에 의해 통합됩니다. DNA 시퀀싱의 목표는 4 개의 질소 염기가 서열에서 발견되는 순서를 나타내는 것이다.
역사
1950 년대 중반 왓슨 (Watson)과 크릭 (Crick) 연구원은 그리스도 론적 기법을 사용하여 DNA 구조를 기술했다. 그러나 이들 연구자들 중 어느 누구도 서열을 발견 할 방법을 찾을 수 없었습니다.
일부 전임자가 있었지만, 가장 중요한 사건은 1977 년 프레 더릭 생어에, 방법의 아버지는 영국의 생화학 자, 생물 과학에 대한 그들의 엄청난 공헌을위한 두 개의 노벨상을 수상했다, 상거 방법을 창조했다.
이 기술은 또한 문헌에서 "사슬 종결"또는 디데 옥시 뉴클레오티드로 알려져있다. 다음으로이 기술의 원리와이 기술의 개선과 혁신을 기반으로 개발 된 기술을 설명 할 것입니다..
생거의 방법
Sanger의 방법 개발은 분자 생물학에서 중요한 사건으로 나타났습니다. 그것은 일반적으로 세포에서 발생하지만, 특별한 구성 요소를 추가하여 DNA 복제 과정의 기본 구성 요소를 포함 : dideoxynucleotides.
반응의 주성분
- DNA 중합 효소 : DNA 중합 효소가 중요한 공정 요소이다. 이 분자는 DNA 가닥의 복제에 관여하는 역할 상보 디옥시리보 뉴클레오티드 트리 포스페이트와 일치하는 새로운 사슬의 합성이다.
시토신 (C)의 3 개 개의 다리가 구아닌 (G)과 이루는 동안 DNA의 티민 (T)의 두 개의 수소 결합을 통해 아데닌 (A)와 결합 리콜.
- 뉴클레오티드 생거 시퀀싱은 두 가지 유형의 뉴클레오티드, 2'- 데 옥시 뉴클레오티드 (으로 dATP, dGTP의, 및 dTTP를 dCTP로 약칭) 및 네 네 dideoxynucleotides (조각은 모세관 배열, ddGTP, ddCTP 및 ddTTP) 특별한 관련.
디데 옥시 뉴클레오티드는 일반적으로 DNA에 혼입되는 단량체와 유사하지만, 그 구조에 -OH기를 갖지 않는다. 이것은 사슬에 새로운 뉴클레오티드를 첨가하는 것을 불가능하게 만든다.
따라서 특수한 뉴클레오타이드가 완전히 무작위 적으로 형성되어 체인에 연결되면 합성이 마비됩니다. 이런 식으로, 반응이 끝날 때, 다른 크기의 사슬이 있고, 각각의 사슬은 반응이 다른 지점에서 멈춘 것이다..
실험적으로 네 가지 시도가 준비됩니다. 각각은 관심있는 생물학적 샘플, 정상적인 뉴클레오타이드 및 4 가지 유형의 특수한 뉴클레오타이드 중 하나에서 추출한 DNA를 포함합니다. 또는 특수 뉴클레오타이드는 형광 마커의 일부 유형으로 표시됩니다 (아래 자동 서열 분석 참조).
결과 읽기
첫 번째 단계는 크기에 따라 각각의 합성 사슬을 분리하는 것입니다. 일부는 특수 기지가 통합 된 위치에 따라 다른 것보다 오래있을 것입니다..
크기를 차별적 인 특성으로 사용하여 혼합물의 성분을 분리 할 수있는 다양한 생화학 기술이 있습니다. 생거 (Sanger) 방법에서, 상이한 사슬은 전기 영동에 의해 분리된다. 이 기법의 가장 정교한 변형에서 모세관 전기 영동이 사용됩니다.
따라서, 긴 가닥은 짧은 변이보다 덜 움직인다. 그런 다음이 시스템은 각 디데 옥시 뉴클레오타이드에 포함 된 마커를 인식하는 리더를 거칩니다. 이 방법으로 시퀀스의 순서를 알 수 있습니다..
이 "1 세대"기술은 1 킬로베이스보다 큰 DNA 조각을 읽을 수 없습니다. 현재 Sanger의 방법은 여러 실험실에서 사용되고 있으며, 일반적으로 현대의 변형이있다. 또한, 가장 복잡한 기법으로 얻은 결과를 뒷받침하는 데 사용되지만 정확도는 떨어집니다.
자동 시퀀싱
대규모 시퀀싱이 필요할 때, 프로세스는 자동화에 의해 가속화됩니다. 이것은 Sanger 체인 터미네이션 방법의 변형으로, 프라이머는 형광 물질로 구분되어 구별됩니다.
이어서, 반응 생성물을 전기 영동으로 수행한다 - 단일 레인 모두에서. 각 단편이 젤의 마지막 부분을 떠날 때 형광 라벨로 신속하게 확인되며 1 %.
가장 정교한 시스템은 로봇에 연결된 컴퓨터로 작동되는 최대 96 개의 모세관 튜브 시스템을 갖추고 있습니다. 즉, 96 개의 DNA 샘플을 동시에 평가할 수 있습니다. 따라서, 전기 영동 및 결과의 분석을 포함하는 공정은 완전히 자동화되어있다.
어느 날이 시스템은 최대 550,000 개의 염기 서열을 가질 수 있습니다. 이 과정에서 인간 작업은 불필요합니다.이 방법을 시작하는 데 약 15 분 밖에 걸리지 않습니다..
Maxam-Gilbert의 시퀀싱
Sanger가 그의 연구를 발표 한 것과 동시에, Allan Maxan과 Walter Gilbert라는 두 명의 연구원은 DNA 서열을 얻기위한 또 다른 방법을 개발했다. 이 방법은 당시 인기를 얻었으나 나중에 Sanger의 방법의 개선으로 옮겨졌습니다.
Sanger의 방법과는 달리 Maxan과 Gilbert (또는 화학 서열 분석기)의 시퀀싱은 하이브리드 화 반응을 포함하지 않습니다. 이 방법론은 한쪽 끝에 반응 제로 마킹을하고, 그 다음에 정제 과정을 거친다..
이 기법의 부정적 측면 중 하나는 엄청난 복잡성과 사용자에게 위험한 화학 물질의 사용에 있습니다. 화학적 분해는 DMS, 포름산, 히드라진 및 히드라진과 염.
절차
프로토콜은 인광체 마커 32가있는 가닥의 5 '끝에서 라벨링으로 시작한 다음 질소 염기의 화학적 변형이 일어나 분리됩니다. 마지막으로 무 지방 영역의 분할이 발생합니다.
먼저 서열화 될 사슬이 더 작은 사슬로 단축됩니다. 이 단계는 제한 효소로 수행되어 극단적 인 결과를 초래합니다.
다음으로, 알칼리 포스 파타 아제를 사용하여 반응을 수행하는데, 그 목적은 인산기를 제거하는 것입니다. 따라서, 폴리 뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 표지를 수행 할 수있다.
사슬은 변성됩니다 (두 가닥이 열렸습니다). 그런 다음 화학 물질을 적용합니다. 이러한 절단 반응은 제어 된 방식으로 이루어지며 각 화학 물질이 적용될 때 어떤 유형의 결합이 깨지게됩니다.
결과 읽기
Sanger 방법에서와 같이, 결과의 판독은 전기 영동 시스템에서 얻어진 체인의 크기에 의한 분리를 포함한다. 폴리 아크릴 아미드로 구성된 시스템은 겔을 판독하기에 매우 적합한 해상도를 얻을 수 있습니다.
대규모 시퀀싱
대규모 시퀀싱은 NGS로 축약 된 일련의 새로운 방법을 영어에서 "차세대 시퀀싱 ".
NGS로 분류 된 방법은 이전 단계의 DNA 증폭이 필요합니다 (단일 분자에서는 작동하지 않습니다). 또한 사용되는 플랫폼은 다양합니다. 가장 많이 사용되는 방법의 원리는 다음과 같습니다.
파이로 시퀀싱
그것은 새로운 핵산이 DNA 가닥에 추가 될 때마다 발생하는 피로 인산염의 방출을 모니터링하는 것을 포함합니다. 새로운 뉴클레오타이드가 도입 될 때마다 (카메라에 의해 검출 될 수있는) 발광이 발생하도록 효소 시스템이 결합된다.
이 과정은 빛이 방출되는지 여부를 확인하기 위해 각 질소 성 염기의 별도 배양으로 시작됩니다. 파이로 시퀀싱은 긴 스트랜드의 판독을 수행 할 수 있지만 발견 된 오류율은 높습니다..
합성에 의한 시퀀싱
이것은 표지 된 뉴클레오타이드의 편입을 포함한다. 이들 형광 성분을 첨가하고, 세척하고, 삽입 된 뉴클레오타이드를 기록한다. 그런 다음, 뉴클레오티드 라벨링이 제거되고, 가닥의 합성이 계속 될 수 있습니다. 다음 단계에서, 표지 된 뉴클레오타이드 또한 혼입 될 것이며, 언급 된 단계는 반복 될 것이다.
형광 마커가 완전히 제거되지 않은 경우이 기술의 단점이 있습니다. 이러한 배출로 인해 백그라운드 오류가 발생하여 심각한 오류가 발생합니다.
라이 게이션에 의한 시퀀싱
이 기술은 DNA 중합 효소를 사용하지 않기 때문에 다른 기술과 다릅니다. 대신,이 방법론의 주요 효소는 리가 아제 (ligase)입니다. 여기에는 형광 표지 된 DNA 단편이 사용되며, 효소에 의해 결합되어 검출된다.
이 기술의 가장 큰 문제점은 처리 할 수있는 매우 짧은 길이의 단편입니다.
이온 시퀀싱 급류
이 기술은 H 이온의 측정을 기반으로합니다.+ 새로운 뉴클레오티드가 도입 될 때마다 방출된다. 이 원리는 파이로 시퀀싱과 매우 유사하지만 훨씬 저렴합니다..
예제들
인간 게놈의 시퀀싱
인간의 게놈을 시퀀싱하는 것은 물론 과학의 역사에서 가장 유명한 경쟁 중 하나로서, 생물학의 가장 유망한 과제 중 하나였다. 사실, 게놈 시퀀싱 프로젝트에 참여 과학자 것이 경쟁되었다.
1990 년에 그는 유명한 과학자 인 노벨상 수상자 인 James Watson이 이끄는 "human genome project"를 시작했습니다. 1 년 후, 1991 년 Venter는 Watson을 "치고"그 전에 게놈을 시퀀싱하는 과제를 수행합니다. 그러나 1992 년 왓슨은 은퇴했고 다른 연구원이 그 명령을 받았다..
1995 년에 Venter는 무작위 시퀀싱 방법으로 박테리아 게놈의 완전한 시퀀싱에 성공했다고 발표했습니다. 마찬가지로 반대 팀은 1 년 후 이스트 게놈의 서열을 발표했다.
2000 년에 경주가 종료되었습니다. 두 회사는 완전한 게놈의 예비 결과를 과학에서 가장 권위있는 2 개의 저널에 발표했습니다. 자연 및 과학.
그러나 과학자들은 제안서를 개선하기 위해 계속 노력했으며 2006 년에 서열은 특정 인간 염색체.
중요성 및 응용
DNA와 같이 분자의 뉴클레오타이드의 순서를 아는 것은 생물 학자 및 관련 전문가에게 가치가 있습니다. 이 폴리 누클레오티드의 사슬은 모든 생명체의 발달과 유지에 필요한 모든 정보를 담고 있습니다..
이러한 이유 때문에이 서열에 대한 지식은 생물학적 연구에 필수적입니다. 근본적으로 시퀀싱은 우리가 생물학적 시스템의 가장 중요한 특성 중 하나를 측정하고 그것들 사이의 차이점을 확립하도록 허용합니다.
시퀀싱 넓게 분류 학자들에 의해 사용되는 특정 DNA 서열이 기준 계통 관계를 가정 할 수있는 외에 두 유기체가 같은 종에 속해 있는지의 여부를 결론 지을 수있게 설정된 체계적인.
또한, DNA 염기 서열은 의학 및 진단 분야에서 응용이있다. 예를 들어, (PNS)라는 간단한 염기 다형성을 사용하여 (암과 같은) 특정 질병을 개발하는 경향을 평가하는 순서에 의해 액세스 경제 시스템이 있습니다.
범죄 수사 및 법의학 유형은 또한 시퀀싱 기술을 농축 한, 그것은 범죄의 특정 개인의 참여의 신뢰할 수있는 증거로 사용할 수 있습니다.
참고 문헌
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